Evaluation of Hepatoprotective Activity of Adansonia digitata Extract on Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity in Rats.

forrás: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=PMC4812277


2017-03-14 10:44:16


Abstract

The methanol extract of the fruit pulp of Adansonia digitata L. (Malvaceae) was examined for its hepatoprotective activity against liver damage induced by acetaminophen in rats. The principle depends on the fact that administration of acetaminophen will be associated with development of oxidative stress. In addition, hepatospecific serum markers will be disturbed. Treatment of the rats with the methanol extract of the fruit pulp of Adansonia digitata L. prior to administration of acetaminophen significantly reduced the disturbance in liver function. Liver functions were measured by assessment of total protein, total bilirubin, ALP, ALT, and AST. Oxidative stress parameter and antioxidant markers were also evaluated. Moreover, histopathological evaluation was performed in order to assess liver case regarding inflammatory infiltration or necrosis. Animals were observed for any symptoms of toxicity after administration of extract of the fruit pulp of Adansonia digitata L. to ensure safety of the fruit extract.

1. Introduction

Modern food styles, excessive medications, and exposure to pollutants besides many other factors have led to many serious diseases including liver damage [1]. Production of reactive oxygen species is considered as a crucial factor leading to oxidative damage of tissues. They react with cell membrane; accordingly, many clinical disorders could be attributed to these free radicals [2]. Recently, herbal products have gained attention as a major part of alternative medicine [3, 4]. It is reported that a significant percentage of population depend on natural derived medicines for maintaining health and treatment of diseases [5]. Nowadays, discovery of new drug leads seems to focus on those of plant origin. Herbal drugs play a significant role in the regeneration of liver cells and acceleration of healing process and hence management of many liver disorders [2]. One of the comprehensive examples is silymarin isolated from Silybum marianum. Silymarin is a mixture of phenolic compounds (flavonolignans) well known for their radical scavenging activities and thus plays a role in prevention and treatment of oxidative damage caused by reactive oxygen species. Nowadays, silymarin is considered as a major component of many important pharmaceutical preparations in the market introduced for treatment of liver diseases [2, 6, 7]. Based on the fact that a tremendous number of plants could be considered as a gold mine for discovery of hepatoprotective agents, we launched our study in a trial to investigate the fruit pulp of Adansonia digitata L.

Our aim here is to discover naturally derived therapeutic agents with hepatoprotective effect. Our work will focus on Adansonia digitata L. (commonly known as baobab) which is a tree native to Central Africa and belongs to family Malvaceae. The pulp of baobab fruit is a very important food. It is used by dissolving in milk or in water. This solution is used as a drink, in baking, or as a sauce for food. The pulp is considered as a popular ingredient in ice products [8]. Previous chemical investigation reported that A. digitata accumulates flavonoids, terpenoids, steroids, amino acids, vitamins, lipids, and carbohydrates [9]. The dry fruit pulp possesses high percentage of carbohydrates, thiamine, nicotinic acid, and vitamin C; additionally, it reveals potent free radical scavenging activity [8, 10, 11]. Previous reports also indicated that the fruit pulp extract exhibited numerous activities such as anti-inflammatory, analgesic, and antipyretic activities [12]. Since free radical scavenging and anti-inflammatory activities are crucial factors in management of liver damage, so this plant is suggested to be an efficient hepatoprotective agent. In our study, the fruit extract was tested for hepatoprotective activity against liver damage induced by acetaminophen in rats. Assessment of liver function was performed by determination of its specific serum markers as well as oxidative stress. The study is also supported by histopathological studies to check any necrosis and inflammatory infiltration.

2. Materials and Methods

2.1. Animals

Seventy male adult Wistar rats of 200–250 g body weight were used in the present study. The rats had free access to food and water. They were maintained at a 12 h light and 12-h dark cycle during the experiment and were allowed to acclimatize for 1 week before starting the experiment. The animal experiments had been approved by the National Committee of Biomedical Ethics, King Abdulaziz University, Jeddah, Saudi Arabia (reference number: 163-15).

2.2. Drugs

Acetaminophen and silymarin were purchased from Sigma, Egypt. Silymarin was given orally once a day for one week by gavage at a dose of 100 mg/kg [13]. Adansonia digitata extract (200 mg/kg) was given orally once daily for one week. Drugs and extract were suspended in distilled water.

2.3. Plant Material and Extract

The fruits were collected from Sudan and identified at Faculty of Science, King Abdulaziz University, and a voucher sample was deposited at Natural Products and Alternative Medicine Department, Faculty of Pharmacy, King Abdulaziz University, Jeddah, Saudi Arabia, under registration number AD-2014. The pulp was extracted with methanol (3 × 2000 mL) by maceration at room temperature. The combined methanol extracts were concentrated under reduced pressure and kept in refrigerator till use.

2.4. Acute Toxicity in Rats

To test the acute toxicity of Adansonia digitata extract, four groups of rats were used, six animals each. A. digitata extract was suspended in distilled water and administered orally once daily for one week at four different doses (200, 500, 1000, and 2000 mg/kg). Six rats served as control. During the first hour, rats were observed continuously and then every hour for 12 hours and then every day for one week, to detect any toxicity signs or mortality.

2.5. Acetaminophen-Induced Acute Hepatotoxicity

Acute hepatotoxicity was induced by acetaminophen (2 g/kg) orally on the fifth day, 30 min posttreatment [13, 14].

2.6. Experimental Design

Forty rats were divided into four groups of ten animals each (n = 10) and treated orally as follows:

  •   Group-I (normal): it was used as normal control rats and they were given distilled water orally for seven days.
  •   Group-II (acetaminophen): rats received distilled water orally daily for seven days; on the fifth day rats received oral dose of acetaminophen.
  •   Group-III (acetaminophen + silymarin): rats received silymarin (100 mg/kg) orally daily for seven days; on the fifth day rats received oral dose of acetaminophen.
  •   Group-IV (acetaminophen + extract): rats received extract (200 mg/kg) orally daily for seven days; on the fifth day rats received oral dose of acetaminophen.

On the seventh day, two hours after treatments [14], blood samples were obtained via retroorbital sinus plexus and then rats were sacrificed. Blood was left to clot at room temperature and the serum was obtained by centrifugation at 4000 rpm for 15 min and kept at −20°C for further biochemical analysis. Two portions of liver tissues were obtained. The first portion was immediately stored at −80°C till it was used for the different biochemical measurements, while the second portion was embedded in 10% formalin and processed for histopathological assay. Tissue sections of liver were stained with hematoxylin and eosin (H&E).

2.7. Measurement of Liver Function

To evaluate liver function, Alanine Amino Transaminase (ALT), Aspartate Amino Transaminase (AST), alkaline phosphatase (ALP), and total bilirubin were measured spectrophotometrically using commercial kit from BioMed Diagnostics (White City, OR, USA). Total protein was measured by a colorimetric method using a kit from Diamond Diagnostics (Cairo, Egypt) following the manufacturer's protocol.

2.8. Measurement of Lipid Peroxide (Measured as MDA)

MDA was determined in liver homogenates spectrophotometrically as thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) [15].

2.9. Measurement of Glutathione (GSH)

GSH level was determined in the homogenates of liver following the method of Ellman [16].

2.10. Measurement of Superoxide Dismutase (SOD)

SOD activity was measured according to the method of Marklund [17].

2.11. Measurement of Catalase Activity (CATA)

The activity of catalase was measured in the homogenate of liver by spectrophotometer using CATA assay kits (Bio-Diagnostic, Egypt) as described by Aebi, 1984 [18].

2.12. Statistical Analysis

The obtained data were represented as mean ± standard deviation (SD). Comparisons between groups were performed using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni's multiple comparison test [19]. All P values reported are two-tailed. P < 0.05 was considered statistically significant. The data were analyzed using the Statistical Package of Social Sciences (SPSS) program version 16.

3. Results

3.1. Acute Toxicity Study

After oral administration of Adansonia digitata extract for seven days, no mortalities were reported up to 2000 mg/kg, and hence 1/10th of the maximum dose administered (i.e., 200 mg/kg, p.o.) was selected for the present study.

3.2. Effect of Adansonia digitata Extract and Silymarin on Liver Functions Measured as ALT, AST, ALP, Bilirubin, and Total Protein

The results of the liver function tests are shown in Table 1. Administration of acetaminophen resulted in a significant (P < 0.05) elevation of hepatospecific serum markers ALT, AST, ALP, and total bilirubin. On the other hand, there was a significant reduction in the total protein in comparison with the normal control rats. These deleterious effects of acetaminophen were significantly (P < 0.05) alleviated by pretreatment with either silymarin or Adansonia digitata extract compared to the acetaminophen group. We did not find any significant difference between silymarin treated rats and Adansonia digitata extract treated rats (Table 1).

Table 1
Effect of Adansonia digitata extract on serum liver enzymes (ALT, AST, and ALP), total bilirubin, and total protein in acetaminophen-induced liver damage in rats.

3.3. Effect of Adansonia digitata Extract and Silymarin on Acetaminophen-Induced Changes in Liver MDA, GSH, SOD, and CAT Activities

Acetaminophen-induced oxidative stress in liver was in the form of significant elevation (P < 0.05) of MDA levels associated with significant (P < 0.05) reduction in SOD, GSH activities, and CATA levels compared with the normal animals (Figures (Figures1114). These deleterious findings induced by acetaminophen administration were improved significantly (P < 0.05) upon treating the animals with either silymarin or Adansonia digitata extract compared to acetaminophen group. There was no significant difference between silymarin and Adansonia digitata extract treated groups, suggesting that Adansonia digitata extract has the same ameliorating effect as the standard reference drug silymarin (Figures (Figures114).

Figure 1
Effect of Adansonia digitata extract (200 mg/kg) and silymarin (100 mg/kg) on liver lipid peroxides (measured as MDA) concentration in acetaminophen-induced hepatotoxicity in rats. Each point represents the mean ± SD of ten rats. ...
Figure 2
Effect of Adansonia digitata extract (200 mg/kg) and silymarin (100 mg/kg) on glutathione (GSH) level in acetaminophen-induced hepatotoxicity in rats. Each point represents the mean ± SD of ten rats.  Significant ...
Figure 3
Effect of Adansonia digitata extract (200 mg/kg) and silymarin (100 mg/kg) on superoxide dismutase (SOD) activity in acetaminophen-induced hepatotoxicity in rats. Each point represents the mean ± SD of ten rats.   ...
Figure 4
Effect of Adansonia digitata extract (200 mg/kg) and silymarin (100 mg/kg) on liver catalase activity (CATA) measured in acetaminophen-induced hepatotoxicity in rats. Each point represents the mean ± SD of ten rats.   ...

3.4. Histopathological Microscopic Study

The histopathologic study of liver tissues revealed that neither necrosis nor inflammation was noticed in the normal control animals which showed normal histologic structure with integrity of hepatic cells (Figure 5(a)). On the other hand, acetaminophen treated group showed necrosis of hepatic cells, inflammation, and lymphocytic infiltrations (Figure 5(b)). Pretreatment with silymarin showed nearly normal liver structure (Figure 5(c)). Pretreatment with Adansonia digitata extract showed parenchyma preservation of hepatocytes with mild necrosis and inflammation (Figure 5(d)).

Figure 5
Histopathological study of liver tissue in control, acetaminophen, silymarin, and Adansonia digitata extract groups of rats. (a) Control group showed normal liver architecture (H&E ×40). (b) Acetaminophen group showed marked hepatic cell ...

4. Discussion

Liver is a large organ responsible for metabolism, detoxification, and protein synthesis [20, 21]. Drug-induced hepatotoxicity is one of the major causes of human mortality all over the world [22]. Protection against acetaminophen-induced toxicity has been used as a test for a potential hepatoprotective agent by several investigators [2326].

Acetaminophen is a common analgesic-antipyretic drug. It is safe in therapeutic doses. Many studies demonstrated the induction of necrosis of hepatic cells by high doses of acetaminophen in animals [2]. After high dosage of acetaminophen, it is extensively metabolized into N-acetyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI) which depletes GSH and leads to hepatotoxicity [13, 14]. Acetaminophen is also shown to directly inhibit cellular proliferation, induce oxidative stress, resulting in lipid peroxidation, deplete ATP levels, and alter Ca++ homeostasis; all of these changes are considered potentially fatal to the cell [27, 28].

To evaluate liver injury, biochemical markers (ALT, AST, and ALP activity and serum bilirubin) levels are measured [29, 30]. In our study the hepatotoxicity due to acetaminophen was confirmed by elevated levels of biochemical parameters like ALT, AST, ALP, and total serum bilirubin with significant reduction in the total protein. This can be explained by the fact that hepatic cells contain a host of enzymes and possess a variety of metabolic activities. ALT was found in higher concentration in cytoplasm and AST particularly in mitochondria. The rise in the ALT is usually accompanied by an elevation in the levels of AST, which play a vital role in the conversion of amino acids to keto acids [31]. In hepatotoxicity the transport function of liver cells is disturbed, causing leakage of plasma membrane [32], therefore resulting in leakage of these enzymes leading to an increase in their serum level. The increased level of ALT and AST in acetaminophen-induced liver injury is an indicator of cellular leakage and loss of membrane integrity of liver cells [33]. Treatment with either silymarin or extract reversed the increased levels of ALT and AST as a result of the stabilization of plasma membrane and the repair of hepatic cell damage induced by acetaminophen [13, 27, 28].

The elevated serum level of alkaline phosphatase is due to its increased synthesis by bile canaliculi cells lining in response to the increased biliary pressure and cholestasis [27, 28]. Hyperbilirubinemia was due to excessive heme destruction and block of bile duct within the liver. Accordingly, there is a mass inhibition of the conjugation reaction and release of unconjugated bilirubin from damaged hepatocytes. Pretreatment with either silymarin or extract effectively controlled alkaline phosphatase activity and bilirubin level that point towards an enhancement in the hepatic cell secretary mechanism [2, 13, 30].

Total protein decreased level is a an indicator of liver damage due to significant fall in protein synthesis. Hypoproteinemia was observed after acetaminophen administration but the level turns towards normal upon pretreatment with either silymarin or extract.

Oxidation of lipids has been suggested for acetaminophen-induced liver injury. In agreement with previous studies [2, 13], we have found an elevation in MDA levels and depletion in antioxidant activity of SOD, CATA, and GSH. The elevated MDA in liver indicates failure of antioxidant defense mechanisms [34]. Pretreatment with silymarin or extract significantly restored these effects. The body defense mechanism prevents cell damage induced by free radicals [28]. This is established by the endogenous antioxidant enzymes, such as GSH, SOD, and CATA [35]. If there is no balance between the production of ROS and antioxidant defenses, oxidative stress results and leads to cell damage. Any compound that has antioxidant properties can prevent or alleviate this damage [28]. In our study, decreased levels of GSH, SOD, and CATA, observed in acetaminophen treated rats, are an indication of tissue damage produced by free radicals. The increase in the concentration of these antioxidant enzymes in liver tissues of silymarin- or extract-treated animals indicates antioxidant effect of silymarin and extract.

The histopathological findings confirmed the biochemical results. Rats that were treated with acetaminophen showed necrosis of hepatocytes which was manifested by disappearance of nuclei and aggregation of inflammatory cells. This may be a result of the formation of free radicals and oxidative stress induced by acetaminophen. These histopathologic findings were ameliorated significantly in the group of rats that were treated with either silymarin or Adansonia digitata extract.

Silymarin and Adansonia digitata extract showed similar hepatoprotective effect in the present study. The possible mechanism of hepatoprotection offered by silymarin is due to its high phenolic content which has been known to contribute to the antioxidant activity [2, 6, 7]. Our results on the extract are compatible with previous reports of chemical investigation of Adansonia digitata which reported that it accumulates flavonoids, terpenoids, steroids, amino acids, vitamins, lipids, and carbohydrates [9], while the dry fruit pulp possesses high percentage of carbohydrates, thiamine, nicotinic acid, and vitamin C. Accordingly, it is possible that the mechanism of hepatoprotective effect of extract might be due to its antioxidant effect which is attributed to its content of vitamin C and the flavonoids that are well known for potent free radical scavenging activity and enhancement of the antioxidant defense system. Moreover, the steroid content with their anti-inflammatory activity can play a significant role in the hepatoprotective effect of the extract.

5. Conclusions

Our study suggested a significant protective effect of Adansonia digitata extract against acetaminophen-induced hepatotoxicity. Adansonia digitata extract exerts this protection through amelioration of lipid peroxidation by its scavenging activity of free radicals and enhancement of the antioxidant defense system.

Acknowledgments

This project was funded by the Deanship of Scientific Research (DSR), King Abdulaziz University, Jeddah, under Grant no. 166/896/D1435. The authors, therefore, acknowledge with thanks DSR technical and financial support.

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this paper.

 


Az Adansonia digitata (Majomkenyérfa, Baobab) kivonat májvédő hatásának kiértékelése az acetaminophennel kiváltott májtoxicitásra, patkányokban

forrás: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=PMC4812277


2017-03-14 10:44:16


Az Adansonia digitata L. (Malvaceae – mályvafélék családja) gyümölcshús metanolos kivonatát tanulmányoztuk annak májvédő hatására nézve acetaminophennel kiváltott károsodás ellen patkányokban. Az alapelv attól függ, hogy az acetaminophen adagolása öszefüggésben van-e az oxidatív stressz kialakulásával. Ezen kívül, hogy a májspecifikus szérum markerek zavart szenvednek-e. A patkányok kezelése az Adansonia digitata L. metanolos gyümölcshús kivonatával az acetaminophen adagolása előtt jelentősen csökkentette a májfunkció zavarait. A májfunkciókat a teljes protein, teljes bilirubin, ALP, ALT és AST értékelésével mértük. Ezen kívül értékeltük az oxidatív stressz paramétereit és az antioxidáns markereket is. Sőt sejtpatológiai kiértékelést is végeztünk azért, hogy felbecsülhessük a máj esetében a gyulladáskeltő átszivárgást vagy nekrózist. Az állatokat megfigyelés alatt tartottuk, vannak-e bármilyen mérgezettségi szimptómáik az Adansonia digitata L. gyümölcspép adagolását követően, hogy biztosíthassuk a gyümölcskivonat biztonságosságát.

1. Bevezetés

A modern ételdivatok, a túlzott gyógyszerfogyasztás és a szennyező anyagoknak való kitettség, sok más egyéb faktor mellett sokféle súlyos megbetegedéshez kell, hogy vezessenek, beleértve a májkárosodást is. [1]. A reaktív oxigénfajták termelését olyan döntő faktornak tekintik, amely a szövetek oxidatív károsodásához vezet. Ezek reakcióba lépnek a sejthártyával: ennek megfelelően sok klinikai betegséget ezeknek a szabadgyököknek lehet tulajdonítani. [2]. Az utóbbi időben gyógynövénytermékek kaptak figyelmet az alternatív gyógyászat részeiként. [3, 4]. Arról számoltak be, hogy a lakosság jelentős része természetes gyógykészítmények függőségében él, hogy fenntarthassa az egészségét vagy hogy kezelhesse a betegségeit. [5]. Manapság úgy tűnik, hogy ezeknek az újfajta drogtípusoknak a felfedezése oda vezetett, hogy a növényi eredetűekre összpontosítanak. A növényi gyógykészítmények jelentős szerepet játszanak a májsejtek regenerációjában és a gyógyulási folyamatok felgyorsításában, ennélfogva sok májbetegség kezelésében [2]. Az egyik ilyen általános példa a Silybum marianumból kivont szilimarin. A szilimarin egy fenolvegyületekből (flavonolignánsokból) álló keverék, melyet jól ismernek szabadgyökfaló tevékenységéről, ami ezért fontos szerepet játszik az oxidatív károsodás megelőzési kezelésében, amely károsodást a reaktív oxigénfajták váltanak ki. Manapság a szilimarint úgy tekintik, mint sok jelentős gyógyszerészeti készítmény fő komponensét a piacon, melyet azért vezettek be, hogy kezeljék vele a májbetegségeket [2, 6, 7].  Arra a tényre alapozva, hogy a növények félelmetes számban tekinthetők valóságos aranybányának a májvédő hatóanyagok felfedezésére, egy kutatási tanulmányba kezdtünk, hogy felderítsük az Adansonia digitata L. gyümölcshús adottságait.

A célunk itt most az, hogy felfedezzük azokat a természetes eredetű gyógyászati hatóanyagokat, amelyeknek májvédő hatása van. A munkánk az Adansonia digitata L. –re fog fókuszálni, (melyet közönségesen csak baobabként ismernek); ez egy Közép-Afrikában honos fa, mely a mályvafélék családjába tartozik. A baobab gyümölcshúsa igen jelentős élelmiszer. Úgy használják, hogy feloldják tejben vagy vízben. Ezt az oldatot italként használják, vagy sütéshez, vagy szószként ételekhez. A gyümölcshúst népszerű anyagnak tekintik jeges termékekben alkalmazva [8].Korábbi kémiai kutatások arról számoltak be, hogy az Adansonia digitata L flavonoidokat, terpéneket, szteroidokat, aminosavakat, vitaminokat. zsiradékokat és szénhidrátokat halmoz fel magában [9].

A száraz gyümölcshús magas százalékban tartalmaz szénhidrátokat, tiamint, nikotinsavat és C-vitamint: ezenkívül igen erős szabadgyök-faló tevékenységet is fejt ki [8, 10, 11]. Korábbi beszámolók azt is jelezték, hogy  a gyümölcshús-kivonat  számos olyan tevékenységet is kifejtett, mint  a gyulladáscsökkentés, fájdalomcsillapítás és lázcsillapítás [12]. Mivel a szabadgyök-faló és lázcsillapító hatás döntően fontos faktorok a májkárosodások kezelésében, ezért ez a növény javasolható, mint hatékony májvédő, az általa tartalmazott hatóanyag miatt. Kísérletünk során a gyümölcskivonatot teszteltük patkányokban acetaminophen adagolásával kiváltott májkárosodás elleni májvédő hatóanyagként. A májfunkció mérését annak specifikus szérum markerének, valamint az oxidatív stressznek a meghatározásával végeztük. A tanulmányt alátámasztják a sejtpatológiai kísérletek is, amelyek bármely nekrózisos, gyulladásos vagy átszivárgási jelenség észlelésére irányultak.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatok

Hetven felnőtt hím Wistar patkányt, egyenként 200-250 g testsúlyúakat, használtunk fel a jelenlegi tanulmányban. A patkányok szabadon fértek hozzá az élelemhez és a vízhez. 12 órán át tartottuk őket világossági, 12 órát pedig sötétségi ciklusban a kísérlet ideje alatt, és megengedtük, hogy akklimatizálódjanak egy héten keresztül, mielőtt elkezdtük volna a kísérletet. Az állatkísérleteket jóváhagyta a National Committee of Biomedical Ethics (Országos Biomedikai Etikai Bizottság, a King Abdulaziz Egyetem, Jeddah, Szaúd-Arábia (referenciaszám: 163-15).

2.2 Drogok

Az acetaminophent és a szilimarint Sigmából, Egyiptomból szereztük be. A szilimarint szájon keresztül adagoltuk naponta egyszer egy héten keresztül gyomorszondán át 100 mg/kg adagban [13]. Az Adansonia digitata kivonatot (200 mg/kg) naponta egyszer adagoltuk szájon át egy héten keresztül. A drogokat és a kivonatot desztillált vizes szuszpenzióban tartottuk.

2.3. Növényi anyag és kivonat

A gyümölcsöket Szudánban gyűjtötték be és a King Abulaziz Egyetem Tudományos Karán azonosították, egy igazoló elismervényt letétbe helyeztek a King Abdulaziz Egyetem Alternatív Gyógyászati Fakultásán, a Gógyszerészeti Karon Jeddahban, Szaúd-Arábiában, az AD-2014 regisztrációs szám alatt. A gyümölcshúst metanollal vonták ki (3 × 2000 mL) macerálással szobahőmérsékleten. A kombinált metanolos kivonatot koncentráltuk csökkentett nyomás alatt, majd hűtőgépben tartottuk a felhasználásig.

2.4. Heveny mérgezettség a patkányokban

Az Adansonia digitata kivonat heveny mérgezésének teszteléséhez patkányokat használtunk, mindegyikhez hatot. Az Adansonia digitata kivonatot desztillált vízben szuszpendáltuk és naponta egyszer adagoltuk egy héten keresztül négy különféle dózisban. (200, 500, 1000, illetve 2000 mg/kg). Hat egér volt kontroll egyed. Az első órában a patkányokat folyamatosan megfigyeltük, majd 12 órán át óránként, hogy észlelhessük a mérgezettségi jeleket, illetve az elhalálozás jeleit.

2.5. Acetaminophen által kiváltott heveny májtoxicitás

Acetaminophennel váltottunk ki heveny májtoxicitást (2 g/kg) szájon keresztül az ötödik napon, 30 perces utókezeléssel [13, 14].

2.6. Kísérleti terv

Negyven patkányt osztottunk szét négy csoportba, minden egyes csoportba tíz állat került (n = 10), és orálisan kezeltük őket az alábbiak szerint:

  • I. csoport (normális): normális kontroll patkányokként használtuk őket, ezek desztillált vizet kaptak szájon keresztül hét napon át.
  • II. csoport (acetaminophen): a patkányok desztillált vizet kaptak szájon keresztül hét napon át; az ötödik napon a patkányok acetaminophent kaptak szájon át adagolva.
  • III. csoport (acetaminophen + szilimarin): a patkányok szilimarint kaptak (100 mg/kg) szájon keresztül hét napon át; az ötödik napon a patkányok orális adagokban kaptak acetaminophent.
  • IV. csoport (acetaminophen + kivonat): a patkányok a kivonatot kapták (200 mg/kg) szájon keresztül naponta hét napon át; az ötödik napon a patkányok acetaminophen adagot kaptak orálisan.

A hetedik napon, két órával a kezelések után [14] vérmintát vettek retroorbitális sinus plexuson keresztül, majd a patkányokat feláldozták. A vért hagyták megalvadni szobahőmérsékleten, majd a szérumot centrifugálással nyerték ki 4000 rpm-en 15 percen keresztül, utána −20°C-on tartották további biokémiai elemzések céljára. Két adag májszövetet vettek ki. Az első mintaadagot azonnal −80°C-ra hűtötték le, amíg fel nem használták különféle biokémiai mérésekhez, a második adagot viszont beágyazták 10%-os formalinba, majd feldolgozták szövetpatológiai kísérlethez. A májszövet metszeteket hematoxilinnel és eozinnal színezték (H&E).

2.7. A májfunkció mérése

A májfunkció kiértékeléséhez alanin-amino-transzaminázt (ALT), aszpartát-amino-transzaminázt (AST), alkalin-foszfatázt (ALP) és teljes bilirubint mértünk spektrometriásan a kereskedelmi BioMed Diagnosztikai (White City, OR, USA) felszerelés használatával. A teljes proteint mértük kolorimetriás módszerrel, egy Diamond C Diagnosztikai felszerelés használatával (Kairo, Egyiptom), követve a gyártó használati protokollját.

2.8. A lipid-peroxid mérése (MDA-val mérve)

Az MDA-t úgy határoztuk meg a máj homogenizátumokban spektrometriásan, mint a tio-barbiturátsav reaktív anyagait (TBARS) ) [15].

2.9. A glutation (GSH) mérése

A GSH szintet a máj homogenizátumokban Ellman módszerének követésével határoztuk meg [16].

2.10. A szuperoxid diszmutáz (SOD) mérése

A SOD aktivitást Marklund módszerének megfelelően mértük [17].

2.11. A kataláz tevékenyéség (CATA) mérése

A kataláz tevékenységet a máj homogenizátumban spektrometriásan mértük CATA mérőfelszerelés segítségével (Bio-Diagnostic, Egyiptom) Aebi 1984-es leírásának megfelelően [18].

2.12. Statisztikai elemzés

A kinyert adatokat úgy ábrázoltuk, mint átlagos ± standard eltérés (SD)-t. A csoportok közötti összehasonlítást egyirányú variációs (ANOVA) elemzésként használtuk, melyet Bonferroni többszörös összehasonlítási tesztjének követésével alkalmaztunk [19]. Minden P értéket kétfarkú (kétoldalú) értékként jegyeztek fel. P < 0.05-et statisztikailag jelentősnek ítéltük meg. Az adatokat a Statistical Package of Social Sciences (SPSS)-ként elemezték (Társadalomtudományok Statisztikai Csomagja .-  M.M.), 16-os program verzió.

3. Eredmények

3.1. Heveny toxicitási kísérlet

Az Adansonia digitata kivonat hét napi alkalmazása után nem jelentettek elhalálozást 2000 mg/kg-ig, és ezért a maximális adag egytizedének adagolását (pl. 200 mg/kg, p.o.) választották ennek a kísérletnek a lefolytatásához.

3.2. Az Adansonia digitata kivonat és a szilimarin hatása a májfunkcióra, ALT, AST, ALP, bilirubin és teljes protein mérésével

A májfunkció tesztek eredményeit az 1. táblázat mutatja. Az acetaminophen alkalmazása jelentős emelkedést eredményezett a májspecifikus ALT, AST, ALP és teljes bilirubin szérum markerek megemelkedésében. Másrészt jelentős csökkenés mutatkozott a teljes proteinben, a normális kontroll patkányok értékeivel összehasonlítva. Az acetaminophennek ezek az ártalmas hatásai jelentősek voltak (P < 0.05), melyeket enyhített az előzetes kezelés szilimarinnal, vagy pedig Adansonia digitata kivonattal, összevetve az acetaminophen csoport eredményeivel. Nem találtunk jelentős különbséget a szilimarinnal kezelt patkányok és az Adansonia digitata kivonattal kezelt patkányok között (1. táblázat).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4812277/table/tab1/

1. táblázat

 

Az Adansonia digitata kivonat hatása a szérum májenzimekre (ALT, AST és ALP), a teljes bilirubinra és a teljes proteinre az acetaminophennel kiváltott májkárosodást szenvedett patkányokban.

3.3. Az Adansonia digitata kivonat és a szilimarin hatása az acetaminophennel kiváltot májelváltozásokra, MDA, GSH, SOD és CAT tevékenységek

Az acetaminophennel kiváltott oxidatív stressz a májban jelentősen megemelkedett MDA szint (P < 0.05) formájában volt jelen, összefüggésben a jelentős SOD, GSH tevékenység csökkenésével (P < 0.05) és a CATA szintekével, összehasonlítva a normális állatokéval (11​14ábrák). Ezek a kártékony eredmények, melyeket az acetaminophen alkalmazása váltott ki, jelentősen javultak (P < 0.05), mikor az állatokat vagy szilimarinnal kezelték, vagy Adansonia digitata kivonattal, összehasonlítva az acetaminophen csoporttal. Nem volt jelentős különbség a szlimarin és az Adansonia digitata kivonattal kezelt csoport között, ami azt sugallja, hogy az Adansonia digitata kivonatnak ugyanolyan jótékony/gyógyító hatása van, mint a standard referencia drogként alkalmazott szilimarinnak (​114 ábrák).

http://medpublics.com/images/study58/1.jpg

 

Az Adansonia digitata kivonat (200 mg/kg) és a szilimarin (100 mg/kg) hatása a máj lipid-peroxid koncentrációira (MDA-val mérve) az acetaminophennel kiváltott májmérgezettség esetén patkányokban. Minden egyes pont a tíz patkány átlagos ± SD-jét ábrázolja…

 

http://medpublics.com/images/study58/2.jpg

 

Az Adansonia digitata kivonat (200 mg/kg) és a szilimarin (100 mg/kg) hatása a glutation (GSH) szintre az acetaminophen által kiváltott májmérgezettség esetén patkányokban. Minden egyes pont a tíz patkány átlag ± SD-jét ábrázolja. „Jelentős…

 

http://medpublics.com/images/study58/3.jpg

 

Az Adansonia digitata  kivonat (200 mg/kg) és a szilimarin (100 mg/kg) hatása a szuperoxid diszmutáz (SOD) tevékenységre az acetaminophen által kiváltott májmérgezettség esetén patkányokban. Minden egyes pont a tíz patkány átlag ± SD-jét ábrázolja. „Jelentős…

 

http://medpublics.com/images/study58/4.jpg

Az Adansonia digitata kivonat (200 mg/kg) és a szilimarin (100 mg/kg)hatása a máj kataláz (CATA) tevékenységre, melyet az acetaminophen által kiváltott májtoxicitást szevedett patkányokban mértek. Minden egyes pont a tíz patkány átlag ± SD-jét ábrázolja. „Jelentős…

 

3.4. Szövetpatológiai mikroszkópos tanulmány

A májszövetek szövetpatológiai tanulmányai feltárták, hogy sem a nekrózis, sem a gyulladás nem volt jelezhető a normál kontroll állatokban, ami azt mutatta, hogy normális hisztológiai struktúra van jelen a májsejtek teljességével egységben (5(a) ábra) Másrészt az acetaminophennel kezelt csoportnál a májsejtek nekrózisa volt kimutatható, gyulladás, valamint limfocita-átszivárgás (5(b) ábra). A szilimarinnal való előzetes kezelés megközelítőleg normális májstruktúrát mutatott ki (5(c) ábra). Az Adansonia digitata kivonattal való előzetes kezelés a májsejtek parenchyma (sejtszövet, működő szövet) megtartást mutatott enyhe nekrózissal és gyulladással (5(d) ábra).

http://medpublics.com/images/study58/5.jpg

A patkányok acetaminophennel, szilimarinnal és Adansonia digitata kivonattal kezelt csoportjainak szövetpatológiai tanulmánya. (a) A kontrollcsoport normális májszerkezetet mutatott (H&E ×40). (b) Az acetaminophennel kezelt csoport májsejtjei markánsan megmutatkoztak…

Go to:

4. Vitaanyag

A máj egy nagy szerv, mely felelős az anyagcseréért, a méregtelenítésért és a fehérjeszintézisért [20, 21]. Világszerte a drogok által kiváltott májmérgezettség az egyik legfőbb oka az emberi halandóságnak [22]. Számos kutató az acetaminophen által kiváltott mérgezésekkel szembeni védekezést tesztelte a lehetséges májvédő hatóanyagokkal [2326].

Az acetaminophen egy közönséges fájdalomcsillapító-lázcsillapító drog. Gyógyászati adagokban biztonságos. Sok kísérlet kimutatta már, hogy a nagy dózisú acetaminophen a májsejtek elhalását váltja ki az állatokban [2]. Az acetaminophen magas dózisa után széleskörűen átalakul az anyagcsere folyamán N-acetil-p-benzokvinoneiminné (NAPQI), ami kiüríti a GSH-t és májmérgezettséghez vezet [13, 14]. Az acetaminophenről azt is kimutatták, hogy közvetlenül gátolja a sejtszaporodást, oxidatív stresszt vált ki, ami lipid peroxidációhoz vezet, kimeríti az ATP-szintet és megváltoztatja a Ca++ homeosztázist: mindezeket az elváltozásokat a sejtek számára lehetségesen fatálisnak ítélik meg [27, 28].

A májkárosodás kiértékeléséhez biomarkereket (ALT, AST és ALP), valamint szérum bilirubin szinteket mértünk [29, 30]. A kísérletünk során az acetaminophennek betudható májmérgezettséget megerősítette az olyan biokémiai paraméterek megemelkedett szintje, mint az ALT, AST, ALP, valamint a teljes szérum bilirubin jelentős lecsökkenése, a teljes protein jelentős lecsökkenésével együtt. Ezt azzal a ténnyel lehet magyarázni, hogy a májsejtek olyan gazdaenzimeket tartalmaznak, amelyek egy sor anyagcsere-tevékenységet folytatnak. Az ALT magas koncentrációja volt megtalálható a citoplazmában, és az AST különösen a mitokondriumokban.

Az ALT megemelkedését általában az AST szintjének felemelkedése kíséri, ami alapvetően fontos szerepet játszik az aminosavaknak ketasavakká való átalakulásában [31]. Májmérgezettség esetén a májsejtek szállító funkciójában zavar keletkezik, és ez a plazma membránon keresztüli átszivárgásához vezet [32], ennélfogva ezeknek az enzimeknek az elszivárgása emelkedést okoz ezeknek a szérumszintjében. Az acetaminophen által kiváltott májkárosodás során a megemelkedett ALT és AST szintek a májsejtek integritásában a sejtszivárgás/sejtperforáció indikátorai [33]. Akár szilimarinnal kezelik őket, akár a kivonattal, ez visszafordítja az ALT és AST szintjeinek megnövekedését, annak következtében, hogy a plazma membrán stabilizálódik és kijavítja a sejtkárosodást, melyet az acetaminophen váltott ki [13, 27, 28].

Az alkalin foszfatáz megemelkedett szérumszintje annak tudható be, hogy az epevezeték sejtjeinek szintézise megnövekszik, válaszként arra, hogy megemelkedik az epenyomás és a koleosztázis [27, 28]. A hiper-bilirubinémia a túlzott májkárosodásnak volt betudható, valamint az epevezetékben megnövekedett nyomásnak. Ennek megfelelően tömeges gátlás jelentkezik a konjugációs reakcióban és nem konjugált bilirubint bocsátanak ki a sérült májsejtek. Akár szilimarinnal kezelték előzetesen, akár a kivonattal, ezen a ponton hatékonyan ellenőrzött alkalin foszfatáz tevékenység és bilirubin szint mutat rá, hogy fokozódik a májsejtek kiválasztó mechanizmusa irányában [2, 13, 30].

A teljes proteinszint lecsökkenése azt jelzi, hogy májkárosodás következett be a protein-szintézis jelentős visszaesése következtében. Hipoproteinémiát figyeltek meg acetaminophen adagolása után, de ennek szintje ismét megközelíti a normálisat, ha szilimarinnal vagy kivonattal kezelik.

A lipidoxidációt sugallták az acetaminophen által kiváltott májkárosodásra. A korábbi tanulmányokkal egyetértésben [2, 13] mi is úgy találtuk, hogy az MDA szintje megemelkedik, a SOD, CATA és a GSH szintjei pedig hatásukban lemerülnek,  A megemelkedett MDA-szint jelzi ezeknek a mechanizmusoknak a meghibásodását az antioxidáns védelemben [34].  A szilimarinnal vagy a kivonattal való előzetes kezelés jelentősen helyreállítja ezeket a hatásokat. A szervezet védelmi mechanizmusa megelőzi a sejtkárosodást, melyet a szabadgyökök váltottak ki [28]. Ezeket stabilizálják az endogén antioxidáns enzimek, mint pl. a GSH, a SOD és a CATA [35]. Ha nincsen egyensúlyban a ROS termelődése az antioxidáns védelemmel, oxidatív stressz következik be, ami sejtkárosodáshoz vezet. Bármely olyan vegyület, ami antioxidáns tulajdonságokkal bír, meg tudja előzni, illetve enyhíteni tudja az így bekövetkezett károkat [28]. Kísérletünk során A GSH, SOD és CATA szintjének lecsökkenése, melyet acetaminophennel kezelt patkányokon figyeltünk meg, azt jelzi, hogy a szabadgyökök szöveti károsodást okoztak. Ezeknek az antioxidáns enzimeknek a megnövekedett koncentrációja a májszövetekben a szilimarinal vagy kivonattal előkezelt állatokban jelzi a szilimarinnak vagy a kivonatnak az antioxidáns hatását.

A szövetpatológiai leletek megerősítették a biokémiai eredményeket. Azok a patkányok, amelyeket acetaminophennel kezeltek, a májsejtek elhalását mutatták, ami abban mutatkozott meg, hogy eltűntek a sejtmagok, a gyulladásos sejtek pedig összetapadtak. Ez azon szabadgyökök hatásának a következménye lehet, melyek az acetaminophen által kiváltott oxidatív stressz miatt keletkeztek. Ezek a szövetkórtani leletek jelentősen javultak azoknak a patkányoknak az esetében, amelyeket szilimarinnal vagy Adansonia digitata kivonattal kezeltek.

A szilimarin és az Adansonia digitata kivonat hasonló májvédő hatást mutattak jelen kísérlet során. Azok a lehetséges májvédő mechanizmusok, amelyeket a szilimarin kínál, a szilimarin magas fenoltartalmának tudhatók be, melyről úgy tudjuk, hogy hozzájárul az antioxidáns tevékenységhez [2, 6, 7]. Az Adansonia digitata kivonattal kapcsolatos eredményeink egybeesnek a korábbi beszámolókkal, melyeket az Adansonia digitata kémiai kutatásával kapcsolatosan végeztek, és amelyről azt jelentették, hogy összegyűjti a flavonoidokat, terpenoidokat, szteroidokat, aminosavakat, vitaminokat, lipideket és szénhidrátokat [9], míg a szárított gyümölcshús magas koncentrációban tartalmaz szénhidrátokat, tiamint, nikotinsavat és C-vitamint. Ennek megfelelően lehetséges, hogy a kivonat májvédő hatásának mechanizmusa annak az antioxidáns tevékenységnek tudható be, amely C-vitamin és flavonoid tartalmának köszönhető, ezekről pedig köztudott, hogy erős és hatásos szabadgyök-faló hatást fejtenek ki, és ezzel javítják az antioxidáns védelmi rendszer működését. Sőt ezen felül a gyulladáscsökkentő hatású szteroid-tartalom is jelentős szerepet játszhat a kivonat májvédő hatásában.

5. Következtetések

Kísérletünk azt sugallja, hogy az Adansonia digitata kivonatnak jelentős védőhatása van az acetaminophen által kiváltott májmérgezettség ellen. Az Adansonia digitata kivonata úgy fejti ki tevékenységét, hogy javítja a lipid peroxidációt szabadgyökfaló tevékenysége révén, valamint javítja az antioxidáns védelmi rendszer működését.

Elismerések

Ezt a projektet a Deanship of Scientific Research (DSR), a King Abdulaziz Egyetem, Jeddah alapította, Grant no. 166/896/D1435. A szerzők ezért köszönetüket és elismerésüket fejezik ki a DSR-nek a technikai és anyagi támogatásért.

Go to:

Érdekek ütközése

A szerzők kijelentik, hogy nem áll fel érdekütközés ennek a lapnak a megjelentetése révén.


QR-CODE

Download image: Right click, "Image save as..."